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第1章 细胞学实验技术1

第一节 细胞培养1

一、细胞复苏与冻存1

二、原代近曲肾小管上皮细胞的分离培养2

三、原代肾小球内皮细胞的分离培养4

四、原代肾小球系膜细胞的分离培养8

五、原代肾间质成纤维细胞的分离培养10

六、足细胞培养12

七、细胞共培养15

八、成体干细胞培养技术（大鼠骨髓间充质干细胞）16

九、细胞脂质体转染20

十、肾脏细胞电转方法21

十一、细胞原位杂交23

第二节 流式细胞仪技术26

一、普通细胞分选27

二、细胞无菌分选27

三、流式细胞仪检测细胞大小29

四、流式细胞仪检测细胞周期30

五、流式细胞仪检测细胞凋亡32

第三节 共聚焦技术Ⅰ——细胞内蛋白质定位、细胞器及自噬体等亚细胞结构检测36

一、共聚焦显微镜常规检测方法36

二、细胞免疫荧光染色方法38

三、细胞免疫荧光多重染色38

四、细胞内脂肪颗粒染色及检测40

五、细胞骨架蛋白染色及检测41

六、细胞内质网染色及检测43

七、细胞内线粒体染色及检测44

八、细胞内溶酶体染色及检测45

九、细胞内自噬体染色及检测46

第四节 共聚焦技术Ⅱ——活体细胞内离子及功能的实时动态监测47

一、活体细胞内离子动态检测常规方法48

二、细胞胞浆及线粒体Ca2+的染色及检测49

三、细胞内Na+染色及检测51

四、细胞内pH染色及检测51

五、细胞线粒体膜电位的染色及检测53

六、细胞内活性氧（ROS）染色及检测54

七、细胞内钙离子震荡及钙火花检测56

八、荧光光漂白恢复（FRAP）技术检测细胞间通讯58

九、荧光漂白丢失（FLIP）检测细胞膜蛋白的流动性及蛋白质核转位60

十、荧光共振能量转移（FRET）检测蛋白质相互关系62

十一、细胞X-Z纵切扫描检测极性细胞蛋白定位64

十二、细胞及组织切片三维重建66

第五节 共聚焦技术Ⅲ——荧光染料／探针标记样本存在的问题及分析对策70

一、荧光标记样品需要注意的问题70

二、荧光标记实验经常出现的问题及对策71

三、典型举例71

第六节 细胞实验其他技术73

一、MTT测定细胞活力73

二、细胞增殖测定（BrdU技术）75

三、肾脏细胞微分离技术76

四、亚细胞组分分离技术78

第2章 分子生物学实验技术82

第一节 核酸的提取与纯化82

一、DNA的提取与纯化82

二、RNA的提取与纯化84

第二节 PCR技术86

一、普通RT-PCR技术87

二、实时荧光定量PCR技术89

第三节 分子杂交92

一、Southern blot92

二、Northern blot96

三、Western blot98

第四节 基因克隆102

一、酶切反应与DNA片段纯化102

二、连接反应103

三、转化104

四、质粒的提取105

第五节 RNAi实验原理与方法108

一、RNAi的分子机制108

二、siRNA的设计108

三、siRNA的制备109

四、siRNA的转染111

第六节 MicroRNA实验技术112

一、MicroRNA介绍112

二、用MicroRNA芯片技术进行MicroRNA表达谱分析113

三、MicroRNA表达水平的检测方法115

四、MicroRNA靶基因的寻找127

五、MicroRNA靶基因的鉴定128

第七节 基因芯片129

一、实验目的与主要实验原理129

二、实验材料129

三、实验步骤129

四、结果示例130

五、注意事项130

第八节 荧光差异显示-双向电泳分析技术130

一、蛋白质标记与双向电泳131

二、差异蛋白质的鉴定132

第九节 液相质谱联用技术135

一、实验目的与主要实验原理135

二、实验材料135

三、实验步骤135

四、注意事项135

五、结果示例136

第3章 病理学技术138

第一节 常规病理技术138

一、组织的取材与固定138

二、石蜡包埋和塑料包埋技术139

三、组织切片技术140

四、常规染色技术（HE染色）143

五、特殊染色技术144

第二节 免疫病理技术149

一、免疫组织化学染色149

二、免疫组织化学双重染色150

三、免疫荧光染色（直接法）151

四、免疫荧光双重染色153

五、微波石蜡切片免疫荧光标记154

六、微波石蜡切片免疫荧光双（多重）标记155

七、免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策156

第三节 分子病理技术157

一、原位分子杂交的基本原理和过程157

二、原位分子杂交的基本操作步骤158

三、原位分子杂交与免疫组织化学双重染色160

四、组织细胞凋亡检测160

五、组织细胞凋亡与免疫组织化学双重染色162

第四节 电镜技术163

一、透射电镜介绍163

二、透射电镜样品制备163

三、透射电镜的使用166

第五节 激光微切割技术167

第4章 转基因技术169

第一节 显微注射170

一、目的DNA的制备170

二、小鼠的准备和要求170

三、输精管切除术172

四、受精卵的分离172

五、显微注射174

六、受精卵移植177

七、转基因小鼠的鉴定180

八、技术成果181

第二节 胚胎干细胞183

第三节 逆转录病毒感染183

一、原理183

二、操作步骤183

第四节 基因打靶技术184

一、ES细胞的获得184

二、基因载体的构建184

三、基因打靶载体的导入185

四、用选择性培养基筛选已击中的细胞185

五、观察185

第5章 肾脏疾病动物模型186

第一节 血清病肾炎模型186

一、动物186

二、药品及试剂186

三、造模186

四、标本的留取与检测187

第二节 Thy-1肾炎模型188

一、实验目的189

二、实验材料189

三、实验步骤189

四、结果示例190

五、注意事项190

第三节 Heymann肾炎191

一、抗体制备191

二、造模193

第四节 阿霉素肾病模型194

一、材料与方法194

二、模型制作方法194

三、检测项目与方法194

四、结果示例195

五、注意事项195

第五节 抗肾小球基底膜肾炎模型195

一、材料与方法196

二、模型制作方法196

三、检测项目与方法196

四、结果示例197

五、注意事项197

第六节 庆大霉素所致急性肾小管坏死模型197

一、材料与方法197

二、模型制作方法198

三、检测项目与方法198

四、结果示例198

五、注意事项198

第七节 5/6肾切除模型199

一、材料与方法199

二、模型制作方法199

三、检测项目与方法199

四、结果示例200

五、注意事项200

第八节 LPS肾炎模型201

一、器材及试剂准备201

二、步骤201

三、纤维蛋白免疫荧光染色202

第九节 糖尿病肾病203

一、器材及试剂准备203

二、步骤203

第十节 肾脏缺血再灌注损伤模型205

一、实验动物选择及特殊器材205

二、实验设计205

三、实验步骤205

四、病理结果205

五、注意事项205

第十一节 单侧输尿管梗阻模型206

一、实验动物选择206

二、实验设计206

三、实验步骤207

四、病理结果207

五、注意事项207

第十二节 肾移植208

一、实验动物选择及特殊器材208

二、实验设计208

三、实验步骤209

四、注意事项209

第十三节 挤压伤肾损伤模型210

一、肌内注射甘油溶液诱导横纹肌溶解AKI大鼠模型制备210

二、重物压迫下肢肌肉诱导横纹肌溶解AKI大鼠模型211

三、静脉注射骨骼肌匀浆（自体）诱导横纹肌溶解AKI大鼠模型212

第十四节 肾脏发育模型213

一、肾脏发育基因敲除模式213

二、肾脏发育模型制备214

第6章 电生理技术217

一、实验目的217

二、主要动物及仪器217

三、方法及结果218

四、注意事项218

第7章 留取尿液方法220

一、尿液标本的种类220

二、尿液标本留取的注意事项220

第8章 肾脏病生物样本资源库的建设规范222

第一节 肾脏病临床信息数据库的建设222

一、信息采集原则222

二、信息采集流程223

三、信息采集内容224

四、随访信息采集225

五、医学伦理学要求225

六、人员岗位职责225

第二节 肾脏病样本资源库操作规范226

一、样本库建设原则226

二、样本采集范围和分类226

三、采样前准备226

四、样本采集227

五、样本处理228

六、样本运输229

七、样本储存230

八、样本出入库管理230

九、质量控制230

十、实验室安全231

十一、人员岗位职责231

附录A 各实验室岗前培训内容234

附录B 各实验室工作制度238