实用RNAi技术 线虫、果蝇和哺乳动物细胞基因沉默的基本原则与方法【2025|PDF|Epub|mobi|kindle电子书版本百度云盘下载】

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1　RNAi:2002年的重大突破1

1.1 RNAi：功能基因组学研究的工具2

1.2 RNAi的作用机制3

1.3 Dicer：裂解dsRNA的启动器？3

1.4 miRNA与siRNA：参与RNAi的两类小RNA6

1.5 RNA诱导的沉默复合体（RISC）：沉默mRNA的效应器？8

1.6 RNA依赖的RNA多聚酶（RdRp）在RNAi作用中的地位12

1.7 RNAi在基因表达调控中的作用13

1.8　哺乳动物中的RNAi14

1.9　应用16

参考文献17

2　线虫的RNAi23

2.1　引言23

2.2　RNAi在线虫中的应用26

2.3　靶向序列的评价26

2.4　dsRNA的合成27

2.4.1.2　通过PCR/RT-PCR制备DNA模板28

2.4.1　DNA模板的制备28

2.4.1.1　质粒模板28

2.4.2　体外转录获取dsRNA31

2.5　dsRNA的导入34

2.5.1 线虫的解剖学知识35

2.5.2　用于基因沉默的线虫36

2.5.3 线虫培养38

2.5.4　微注射法38

2.5.5　浸泡法39

2.5.6　喂饲法40

2.5.7 喂饲大肠杆菌表达dsRNA所用的DNA模板42

2.5.8　用于表达发夹RNA的DNA模板43

2.5.8.1　线虫启动子44

2.5.8.2　构建反向重复序列载体44

2.6　线虫显微镜计数49

2.7　基因组筛选52

2.8　线虫研究的相关文献53

参考文献54

2.9　相关网站54

3　果蝇的RNAi58

3.1　引言58

3.2　RNAi在果蝇中的应用60

3.2.1　用线性DNA模板制备dsRNA61

3.2.2 用反向重复DNA序列制备dsRNA62

3.2.3　在果蝇细胞株中诱导表达dsRNA67

3.2.4 局限性67

3.3.1　体外转录合成dsRNA68

3.3　合成dsRNA68

3.3.2　反向重复DNA72

3.4　注射78

3.4.1　注射服务78

3.4.2　注射方法78

3.4.3　准备dsRNA或反向重复DNA序列79

3.4.4　胚胎收集79

3.5　细胞系82

3.6.1　S2细胞的复苏和培养84

3.6　细胞培养84

3.6.2　S2细胞的冻存85

3.7　S2细胞的RNAi86

3.7.1 磷酸钙法转染dsRNA87

3.7.2 浸泡法导入dsRNA87

3.8　高通量筛选88

3.9　相关网址90

3.10　果蝇研究的相关书籍和文献90

参考文献91

4.1　引言95

4　哺乳动物的RNAi95

4.2　细胞培养中的瞬时RNAi96

4.2.1　siRNA的化学合成与修饰96

4.2.1.1　优点100

4.2.1.2　局限性100

4.2.2 合成siRNA寡核苷酸101

4.2.3 siRNA设计原则101

4.2.3.1　siRNA序列的偏倚和脱靶101

4.2.3.2　提高siRNA的稳定性102

4.2.3.3　siRNA设计：新的“Tusehl”法则104

4.2.3.4　BLAST、FASTA或Smith-Waterman算法107

4.2.3.5　问题解决108

4.2.3.6　siRNA设计程序和算法108

4.2.3.7　准备siRNA双链体110

4.2.4 酶促合成siRNA110

4.2.4.1　DNA寡核苷酸的设计111

4.2.4.2　体外dsRNA转录113

4.2.5 长片段dsRNA加工118

4.2.5.1　在Hi5昆虫细胞株中表达Dicer119

4.2.5.2　重组Dicer消化dsRNA122

4.2.5.3　大肠杆菌重组RNaseⅢ的制备123

4.3　siRNA导入细胞126

4.3.1 转染127

4.3.2 电穿孔128

4.3.3 用细胞穿透肽（CPP）运载siRNA130

4.3.4 CPP或蛋白质转导结构域（PTD）130

4.3.4.1　siRNA与CPP耦联132

4.3.4.3　酶促合成5′-巯基修饰的siRNA135

4.3.4.2　化学合成5′-疏基修饰的siRNA135

4.3.4.4　半胱氨酸修饰的CPP与siRNA耦联138

4.3.4.5　用肽-siRNA处理细胞140

4.4　siRNA分析142

4.4.1 siRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）142

4.4.2　琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定dsRNA和siRNA146

4.4.2.1　dsRNA和siRNA双链体的检测146

4.4.2.2　同时检测siRNA和mRNA146

4.5 短发卡RNA（shRNA）的RNAi作用147

4.5.1 shRNA表达载体149

4.5.1.1　茎环结构151

4.5.1.2　干扰素样反应152

4.5.1.3　优点152

4.5.1.4　局限性153

4.5.1.5　方法153

4.5.2 慢病毒介导的RNAi155

4.5.2.1　导入问题155

4.5.2.2　局限性157

4.5.2.3　克隆RNAi表达框159

4.5.2.4　克隆策略161

4.6 长发夹RNA（lhRNA）的RNAi作用172

4.6.1 来源于反向重复DNA序列的lhRNA173

4.6.1.1　反向重复DNA序列174

4.6.1.2　高通量方法分离反向重复DNA序列178

4.6.2 用正向重复DNA序列表达lhRNA181

4.6.3　缺失5′-端帽子和多聚腺苷酸（A）尾的反向重复序列183

4.6.4　RNAi与dsRNA脱氨基186

4.7　检测干扰素样反应188

4.7.1 RT-PCR半定量法分析2′-5′-OAS活性190

4.7.2　DNA片段分析191

4.7.3 PKR活性和eIF2α磷酸化分析191

4.8　在哺乳动物细胞中诱导持续性的RNAi194

4.9　RNAi在小鼠中的应用198

4.9.1　高压尾静脉注射198

4.9.2　体内电穿孔199

4.9.5 原核注射建立转基因小鼠201

4.9.3　腺病毒感染成年小鼠201

4.9.4 慢病毒感染建立转基因小鼠201

4.10　备选方法：核酶裂解法制备dsRNA204

4.11　高通量筛选205

4.11.1 条形码shRNA文库构建205

4.11.2 酶修复全基因组shRNA文库207

4.11.3 全基因组siRNA筛选210

4.11.4 RNAi芯片211

4.12.1 学术资源212

4.12　有用的网页及链接212

4.12.2　公司资源213

4.12.3　其他链接213

参考文献214

附录225

附录1　英文简称与中英文全名对照225

附录2　实验方法目录235

附录3　RNAi相关化学试剂和探针供应商237

附录4　名词解释239